Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) В каких случаях назначают фиш анализ

FISH – исследование для дифференциальной диагностики

Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) В каких случаях назначают фиш анализ

[12-052] FISH – исследование для дифференциальной диагностики

23655 руб.

Современный метод цитогенетического анализа, позволяющий определять качественные и количественные изменения хромосом (в том числе транслокации и микроделеции) и используемый для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний крови и солидных опухолей.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ

FISH-тест

FISH-анализ

Синонимы английские 

Fluorescence in-situ hybridization

FISH test

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH, от англ. fluorescence in-situ hybridization) – это один из самых современных методов диагностики хромосомных аномалий. Он основан на использовании ДНК-проб, меченных флуоресцентной меткой.

ДНК-пробы представляют собой специально синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом. Таким образом, ДНК-пробы различаются по составу: для определения разных хромосомных аномалий используются разные, специфические ДНК-пробы.

ДНК-пробы также различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу.

В ходе процесса гибридизации при наличии в исследуемом образце аберрантных хромосом происходит их связывание с ДНК-пробой, которое при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как флуоресцентный сигнал (положительный результат FISH-теста).

При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-пробы в ходе реакции “отмываются”, что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию.

Таким образом, FISH-тест – это не только качественный, но и количественный метод.

FISH-тест обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами цитогенетики. В первую очередь, исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам.

Это основное преимущество FISH по сравнению с классическими способами кариотипирования (например, окрашиванием хромосом по Романовскому-Гимзе), которые применяются только к метафазным ядрам.

Благодаря этому исследование FISH является более точным методом для определения хромосомных аномалий в тканях с низкой пролиферативной активностью, в том числе в солидных опухолях.

Так как в FISH-тесте используется стабильная ДНК интерфазных ядер, для исследования могут быть использованы самые различные биоматериалы – аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, мазки, аспираты костного мозга, биоптаты и, что немаловажно, сохраненные фрагменты ткани, например гистологические блоки.

Так, например, FISH-тест может быть с успехом выполнен на повторных препаратах, полученных из гистологического блока биоптата молочной железы при подтверждении диагноза “аденокарцинома молочной железы” и необходимости определения HER2/neu-статуса опухоли.

Следует особо подчеркнуть, что в данный момент исследование FISH рекомендовано в качестве подтверждающего теста при получении неопределенного результата иммуногистохимического исследования опухоли на онкомаркер HER2/neu(ИГХ 2+).

Другим преимуществом FISH является его способность определять микроделеции, которые не выявляются с помощью классического кариотипирования или ПЦР. Это имеет особое значение при подозрении на синдром Ди Джорджи и велокардиофациальный синдром.

FISH-тест широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний, в первую очередь в онкогематологии. Хромосомные аномалии в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимического исследования являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопролиферативнх заболеваний.

Классическими примерами являются хронический миелолейкоз – t (9;22), острый промиелоцитарный лейкоз – t (15;17), хронический лимфолейкоз – трисомия 12 и другие. Что касается солидных опухолей, наиболее часто FISH-исследование применяется при диагностике рака молочной железы, мочевого пузыря, толстой кишки, нейробластомы, ретинобластомы и других.

Исследование FISH также может быть использовано в пренатальной и преимплантационной диагностике.

FISH-тест часто проводят в сочетании с другими методами молекулярной и цитогенетической диагностики. Результат этого исследования оценивают в комплексе с результатами дополнительных лабораторных и инструментальных данных.

Для чего используется исследование?

  • Для дифференциальной диагностики злокачественных заболеваний (крови и солидных органов).

Когда назначается исследование?

  • При подозрении на наличие злокачественного заболевания крови или солидных опухолей, тактика лечения и прогноз которых зависит от хромосомного состава опухолевого клона.

Что означают результаты?

Положительный результат:

  • Наличие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Отрицательный результат:

  • Отсутствие в исследуемом образце аберрантных хромосом.

Что может влиять на результат?

  • Количество аберрантных хромосом.

Также рекомендуется

  • [12-027] Иммуногистохимическое исследование клинического материала (с использованием 1 антитела)
  • [12-028] Иммуногистохимическое исследование клинического материала (с использованием 4 и более антител) 
  • [12-053] Определение HER2 статуса опухоли методом FISH
  • [12-054] Определение HER2 статуса опухоли методом СISH

Кто назначает исследование?

Онколог, педиатр, акушер-гинеколог, врач-генетик.

Литература

  • Wan TS, Ma ES. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Anticancer Res. 2005 Jul-Aug;25(4):2979-83.
  • Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, Kanavakis E, Mavrou A. Impact of cytogenetic and molecular cytogenetic studies on hematologic malignancies. Chang Gung Med J. 2012 Mar-Apr;35(2):96-110.
  • Mühlmann M. Molecular cytogenetics in metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis. Application in tissue sections and cell suspensions. Genet Mol Res. 2002 Jun 30;1(2):117-27.

Источник: https://helix.ru/kb/item/12-052

Фиш анализ при раке молочной железы (fish тест, исследование, реакция) | Ассута

Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) В каких случаях назначают фиш анализ

Пройти фиш анализ при раке молочной железы предлагает клиника Ассута. Флуоресцентная гибридизация, иначе именуемая ФИШ (FISH) – генетический тест, дающий представление о природе опухоли.

Изучая новообразование методом ФИШ, врач узнает, является ли рак положительным или отрицательным по отношению к гену HER2. Присутствующие в клетках организма копии гена стимулируют рост атипичных раковых клеток.

После пройденной диагностики, врач сможет составить наиболее детальный план лечения.

Современный лабораторный комплекс клиники Ассута проводит ФИШ (FISH) анализ для оценки раковых патологий груди:

  • Уникальное тестирование дает точное представление о характере опухоли, ее особенностях.
  • Частный госпиталь располагает мощными ресурсами для достижения результата.
  • У нас работают лучшие врачи Израиля, диагностика и терапия проводятся по индивидуальным схемам.

Позвоните, чтобы узнать, как оформиться на лечение. Восстановите здоровье в крупнейшем госпитале на территории Ближнего Востока.

Записаться на консультацию

Фиш тест при раке молочной железы – механизм развития онкологии

Рецепторы гена HER2 отвечают за выработку HER2 белков, которые являются рецепторами, присутствующими в злокачественных клетках. При активизации рецепторов в раковые клетки поступает сигнал о необходимости деления и размножения. В норме HER 2 рецепторы регулируют рост клеток молочной железы, поддерживая баланс здоровья в тканях.

Однако доказано, что ген HER 2 избыточно вырабатывается в одном из пяти случаев онкологии. Это означает, что вместо одной копии гена у человека присутствует ген от каждого родителя. Это объясняет избыток HER рецепторов в организме, вызывая бесконтрольный и агрессивный рост опухоли.

Пройти фиш анализ при раке молочной железы необходимо для того, чтобы узнать, насколько причина развития патологии в организме связана с аномальным продуцированием рецепторов.

Вы должны знать, является ли тип рака HER2 положительным или отрицательным. Существуют методы лечения, специально разработанные для рецепторов HER 2 положительного рака груди.

Анализ позволяет не терять время на поиск результативных методов воздействия.

Когда проводится fish реакция при раке молочной железы, врач использует профильные окрашивающие вещества для визуализации хромосомных нарушений. Нанесенный на изучаемые ткани раствор дает возможность увидеть аномалии. Преимуществом ФИШ анализа является то, что с его помощью можно обнаружить генетические отклонения, которые слишком малы для изучения под микроскопом альтернативными методами.

Еще одно достоинство тестирования – результаты пациент получает на руки спустя несколько дней в то время, как другие методы дают расклад лишь через несколько недель. Кроме определения злокачественной опухоли молочной железы фиш тест используется в диагностике раковой патологии мочевого пузыря, при определении лейкозов.

Виды анализов

Для выяснения положительной или отрицательной природы HER2 врачи клиники Ассута направляют пациента на тестирование в собственную лабораторию. Различают два типа тестов:

  • Иммуногистохимия – IHC выявляет большое количество белка. Во время испытания патолог изучает ткани под микроскопом, используя специальные окрашивающие вещества. Дальнейшие испытания не требуются при 1+ результате или 0 показателе. Результат 2+ считается неопределенным, при котором необходимо пройти дальнейшее тестирование. Результат 3+ подтверждает негативный сценарий.
  • МОГ тест (гибридизация) – следующий шаг при подозрении на онкологию. Важно, чтобы анализ проводил опытный патолог, что позволит исключить ошибки при расшифровке полученных результатов. Существует два основных типа теста – фиш исследование при раке молочной железы и метод светлого поля. Положительный фиш тест является окончательным методом диагностики.

Очень редко fish анализ бывает неопределенным или двусмысленным. При таком стечении обстоятельств требуется еще одна биопсия и новая фиш реакция при раке молочной железы для подтверждения диагноза.

Как проходит фиш тест при раке молочной железы – руководство для пациента

Для грамотной диагностики статуса HER 2 врач проводит биопсию, в процессе которой изымает образцы измененных патологией тканей. В большинстве случаев используется местная анестезия, чтобы нейтрализовать дискомфорт. В дальнейшем извлеченная ткань направляется на исследование в лабораторию, где с ней работает патолог.

Очень важно, чтобы лаборатория являлась авторитетной в медицинской среде, потому что от правильности постановки диагноза напрямую зависит жизнь пациента. Доказано, что fish тест при раке молочной железы – безопасная процедура. Он не требует много времени, отдельных процедур кроме биопсии и дополнительной травматизации тканей.

Почему изначально проводится IHC тестирование? Это проще и доступнее. Однако, если анализы неубедительны, тестирование ФИШ обязательно к проведению. В редких случаях возможна повторная биопсия с забором проб. Но это, действительно, происходит крайне редко.

Если анализ fish при раке молочной железы показал положительный HER2 результат, вам будет назначено эффективное лечение HER2 положительного рака. Несмотря на то, что это агрессивная форма патологии, перспективы для людей с таким диагнозом в последние годы значительно улучшились.

Это связано с новыми и эффективными методами лечения рака груди в Израиле, нацеленными на HER 2 рецепторы.

Источник: https://msassuta.com/otdeleniya/onkologiya/rak-grudi/diagnostika-raka-grudi-v-izraile/fish-analiz-pri-rake-molochnoi-zhelezy

FISH-анализ в онкологии в Москве, анализ-FISH при раке молочной железы в Европейской клинике

Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) В каких случаях назначают фиш анализ

Рак молочной железы является самым частым онкологическим заболеванием у женщин. Поэтому данной проблеме уделяется очень много внимания со стороны врачей и ученых. На сегодняшний день методы диагностики рака молочной железы существенно изменились и усовершенствовались. Одним из таких методов является флуоресцентная гибридизация in situ или FISH (фиш).

Зачем нужен FISH-анализ?

Рак молочной железы может иметь различный гормональный статус, который очень важно определить для подбора дальнейшего лечения. Выделяют несколько биологических маркеров опухоли, одним из которых является рецептор HER2-neu. Он отвечает за рост и деление клеток.

Примерно в 25-30% случаев рака молочной железы отмечается увеличение экспрессии данного гена, который кодирует одноименный белок HER2-neu. В связи с этим, клетки начинают бесконтрольно делиться, а сама опухоль становится агрессивной и характеризуется неблагоприятным прогнозом.

Зная эту особенность, ученые смогли разработать специальный лекарственный препарат. Это моноклональное антитело, которое позволяет «заблокировать» белок HER2-neu и снизить агрессивность рака молочной железы.

Однако для того, чтобы этот препарат оказался эффективным, необходимо точно определить, что у конкретного пациента имеется повышенная экспрессия белка HER2-neu в опухолевой ткани. Эту задачу как раз и призван решить фиш тест.

Когда назначается FISH тест

Определить статус HER2-neu в клетках рака молочной железы можно разными способами. Наиболее простым и дешевым является иммуногистохимическое исследование. Однако в части случаев оно не дает точного ответа. При анализе результатов, врач определяет статус HER2-neu в баллах или плюсах (+).

  • 0-1+ — результат негативный.
  • 2+ — статус не определен.
  • 3+ — статус позитивный.

FISH тест назначается при неопределенном результате иммуногистохимического исследования (2+). В этом случае нельзя достоверно оценить экспрессию гена, следовательно, нельзя быть уверенным, что пациенту поможет соответствующее лечение.

На сегодняшний день не существует FISH-тестов, позволяющих проводить раннюю диагностику рака молочной железы. Это исследование показано тем женщинам, у которых уже опухоль выявлена, удалена и которым требуется подобрать лечение.

Подготовка к тесту и алгоритм его проведения

Для того чтобы провести FISH исследование, необходимо получить образец опухолевых клеток. Как правило, к тому моменту, когда женщине назначается данный анализ, она уже прошла все необходимые диагностические процедуры, в том числе биопсию. Однако в некоторых случаях требуется повторное проведение биопсии молочной железы, о чем врач предупредит заранее.

На следующем этапе обязательно проводится иммуногистохимическое исследование. Во-первых, оно более дешевое и простое, во-вторых, оно тоже с большой точностью может помочь определить статус HER2-neu в молочной железе. Если результат иммуногистохимии оценивается в 2+, то материал отправляется на FISH исследование.

Тест проводится на таком же материале молочной железы, который использовался при проведении иммуногистохимии. Метод FISH подразумевает использование ДНК-зондов, которые связываются с определенными мишенями в клетке. Для того чтобы зонд можно было визуализировать, его помечают специальными флуоресцентными красителями.

При оценке статуса HER2-neu интерес представляет 17 хромосома, на которой расположен ген, который кодирует данный белок.

В процессе проведения FISH теста можно оценивать как количество хромосом, так и количество копий гена в клетках рака молочной железы.

Для этого ткань проходит пробоподготовку и помечается ДНК-зондом, после чего врач оценивает срез под флуоресцентным микроскопом и дает свое заключение.

Достоинства и недостатки FISH теста

В настоящее время метод FISH позволяет с высокой точностью определить HER2-статус опухоли молочной железы и подобрать необходимое лечение.

Такая необходимость возникла с разработкой лекарственного препарата Трастузумаб (Герцептин).

Согласно исследованиям, при назначении его на ранних стадиях рака молочной железы удается снизить вероятность рецидива заболевания на 50%, а показатели смертности — на 30%, что является очень хорошим результатом.

Препарат оказывает действие только на те клетки рака молочной железы, которые отличаются высокой гиперэкспрессией HER2-neu. В остальных случаях Герцептин будет неэффективен. Среди других достоинств, которыми обладает тест FISH, можно отметить относительно быстрые сроки выполнения анализа (около 2-3 дней), высокую чувствительность и специфичность.

Для проведения FISH теста требуется дорогостоящее оборудование (флуоресцентный микроскоп) и расходные материалы, поэтому его пока предлагают лишь крупные клиники и диагностические центры. Кроме того, стоимость самого исследования также является высокой, но при этом полностью оправдывает себя.

Тест FISH — это один из методов современной диагностики рака молочной железы, который применяется только в специфических ситуациях. Несмотря на высокую точность, его не требуется назначать всем пациентам подряд, но при наличии показаний, этот метод может существенно помочь в выборе метода лечения и улучшить прогноз при раке молочной железы.

Записьна консультациюкруглосуточно+7 (495) 151-14-538 800 100 14 98

Источник: https://www.euroonco.ru/glossary-a-z/analiz-fish-pri-rake-molochnoj-zhelezy

Фиш анализ при раке молочной железы

Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) В каких случаях назначают фиш анализ

Для лечения онкологических патологий ученные пока не разработали совершенных методов терапии, способствующих выздоровлению. Фиш-анализ при раке молочной железы дает надежду на ранее диагностирование заболевания. Метод позволит женщинам начать лечение на самых ранних этапах, что и повысит шансы на исцеление.

Что это такое?

Фиш-исследование при раке молочной железы является одним из прогрессивных и актуальных средств раннего диагностирования. В переводе с английского обозначает тест на внутриклеточную флуоресцентную гибридизацию.

При помощи этого ген-теста онкологи анализируют происхождение опухолей.

Также анализ указывает на положительное или отрицательное влияние гена, принимающего участие в патогенезе и прогрессировании рака агрессивного типа — HER2.

Постоянное развитие научных изысканий влияет на удешевление FISH-теста и делает его доступным все большему количеству женщин.

При каких симптомах рекомендуют проведение теста?

Для определения онкологии груди рекомендуется регулярно проводить самообследование. Первые симптомы, которые должны насторожить и побудить женщину пойти к врачу:

Увеличение лимфатических узлов в подмышках может сигнализировать про развитие заболевания.

  • увеличение лимфатических узлов в подмышках;
  • уплотнения в зоне груди;
  • боль при нажатии на сосок;
  • ассиметричность молочных желез;
  • дискомфорт и боль в одной из грудей;
  • выделения из сосков;
  • морщинистая кожа на молочной железе;
  • втянутый сосок.

Подготовка и сдача анализа

Никакой особой подготовки для прохождения на фиш-тест не требуется. Нельзя только употреблять спиртные напитки, как и перед сдачей любых анализов и употреблять жирную, мясную и тяжелую пищу. Еда должна быть легкой, лучше, если это будут овощные блюда и соки. Fish-тест при раке молочной железы — безвредная и безопасная процедура, которая проходит в два этапа:

  • Гистологический. Под местным воздействием наркоза проводится биопсия биоматериала из груди. Полученный материал обрабатывается специальным красящим веществом с флуоресцентными маркерами. По своим химическим качествам эти маркеры связываются исключительно с обозначенными хромосомами и их наборами в клетках. В результате исследований видны наиболее окрашенные маркером хромосомные наборы, что и указывает на степень изменений в геноме по онкологической принадлежности.
  • Фиш-анализ. В вену проводят инфузию компонента ДНК — дезоксирибонуклеиновую кислоту, окрашенную специфическими маркерами. Метки-маркеры встраиваются в геномы на клеточном уровне. Исследование проводится в присутствии пациентки, а итоги анализа предоставляются сразу.

Что показывают результаты?

Fish-анализ при раке молочной железы показывает такие итоги:

  • Гистологическое исследование. Результаты выставляются по насыщенности маркеров на участках хромосомных наборов. Число 1 и менее означает, что опасности нет. Цифра обозначает пограничное состояние, требующее дополнительных анализов. Числом 3 обозначают развитие онкологического процесса.
  • Фиш-реакция при раке молочной железы. Отрицательный результат реакции означает, что молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты не принимают участия в патогенезе атипичных клеток. При развитии злокачественного образования ген HER2 не влияет на раковую клетку. При положительной реакции в два раза повышается скорость деления генов, участвующих в патогенезе онкологических молекул.

Достоинства и недостатки

Плюсом фиш-анализа является:

  • Скорость. Результаты готовы в течение нескольких дней.
  • Обнаружение предрасположенностей к другим патологиям.
  • Безопасность. Биопсия проводится с наименьшим травмирование пациентки.
  • Выявление склонности к раковым заболеваниям.

Фиш-тесты согласно источнику maximus2012.nethouse.ru/static/doc/0000/0000/0349/349982.sqrj348c07.pdf позволяют установить, насколько организм склонен к онкологии.

К минусам можно отнести такие показатели:

  • Специфичность маркеров. Их не применяют на некоторых зонах хромосомного набора.
  • Не всегда правильные результаты, иногда случаются ошибки.
  • Высокая стоимость процедуры.

При наименьших подозрениях на изменение молочных желез необходимо обратиться к маммологу. Существует целый спектр методов исследований на онкологию, в том числе и фиш-тест. Чем раньше будет обнаружен рак или предрасположенность к нему, тем раньше начнется лечение, и тем более благоприятным будет прогноз выживаемости.

Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии

Рак молочной железы (РМЖ) — распространенный вид онкологии и, к сожалению, пока не разработано ни одного способа терапии, дающего полную гарантию излечения. Поэтому лучший выход для больного — профилактика и своевременная диагностика РМЖ. Фиш — анализ при раке молочной железы — это наиболее современный метод исследования, позволяющий направить лечение пациента по наиболее верному пути.

Методы диагностики онкологии груди

Несмотря на огромный накопленный опыт в изучении и лечении этого заболевания, медицина до сих пор не в состоянии указать внешние факторы, вызывающие злокачественную опухоль молочной железы.

Ни один из известных канцерогенов не удается достоверно связать с возникновением этой болезни. Современные способы диагностики в целом дают неплохие результаты и позволяют с высокой точностью определить наличие либо отсутствие заболевания и стадию развития.

Однако не все они дают исчерпывающую информацию, позволяющую точно назначить лечение.

  1. Общий анализ крови — проверяется уровень лейкоцитов, скорость оседания эритроцитов и гемоглобин. Первые два показателя при онкологии увеличиваются, последний, наоборот, понижается. Однако этот анализ позволяет судить лишь о наличии определенных проблем в организме. Поставить точный диагноз «рак молочный железы» с его помощью нельзя, особенно на раннем этапе развития опухоли.
  2. Биохимия — определяет уровень ферментов и электролитов, что позволяет судить о наличии метастазов. Однако эти данные не всегда объективны. Также это исследование показывает наличие в крови некоторых онкомаркеров, которые помогают отследить наличие раковой опухоли и ее дислокацию.
  3. Спектральный анализ позволяет определить наличие рака с вероятностью более 90%, в том числе и на ранней стадии.Метод основан на изучении крови под инфракрасным излучением, что позволяет определить ее молекулярный состав.
  4. Биопсия — производится путем забора образца ткани из груди и дальнейшего цитологического анализа, который определяет наличие раковых клеток и их количество, которое зависит от степени развития заболевания.
  5. Генетический анализ определяет предрасположенность пациента к образованию рака груди.Он проводится путем обнаружения в крови определенных генов, отвечающих за передачу рака от поколения к поколению.

Однако новейшим и эффективным методом исследования на сегодняшний день является так называемый FISH (фиш) тест. Расшифровка аббревиатуры в переводе с английского звучит как «внутриклеточная флуоресцентная гибридизация».

Метод фиш — тестирование является относительно новым — он используется с 1980 года. Однако несмотря на сложность и высокую цену, он успел заслужить положительные отзывы как от врачей, так и от пациентов, которые благодаря ему успешно избавились от рака.

Источник: https://dou99.ru/molochnaya-zheleza/fish-analiz-pri-rake-molochnoj-zhelezy

Флюоресцентная гибридизация in situ

Плюсы и минусы фиш-исследования в онкологии. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) В каких случаях назначают фиш анализ

Перейти в раздел Приборы и реагенты для FISH – анализа 

Метод гибридизации in situ* (на месте, лат.

) основан на способности ДНК или РНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК / РНК – зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер.

С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.

Для проведения гибридизации in situ пригодны цитологические или гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приготовленные по стандартным методикам.

В условиях клинической цитогенетической лаборатории используют препараты культивированных лимфоцитов периферической крови, клеток цитотрофобласта хорионального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, а также мазков клеток буккального эпителия и крови.

Метод гибридизации in situ имеет особое значение для практической цитогенетики, благодаря разработке неизотопного варианта, основанного на использовании зондов, меченных нерадиоактивными модифицированными нуклеотидами.

Неизотопные варианты гибридизации на препаратах (в особенности флюоресцентные) имеют ряд преимуществ по сравнению с изотопными: большую разрешающую способность, которая равна разрешающей способности микроскопа (0,1 – 0,2 мкм), отсутствие необходимости в статистической обработке результатов, быстроту и безопасность для здоровья исследователей

Кроме того, комбинация различно модифицированных проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одной клетке или на одной метафазной пластинке.

А использование в качестве ДНК-зондов повторяющихся последовательностей, меченых флюорохромами, сокращает время проведения процедуры до 7 – 9 часов (классический неизотопный вариант гибридизации занимает два дня, изотопные варианты от недели до месяца), что особенно важно для пренатальной диагностики. Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ численных нарушений хромосомного набора, как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах.

Принцип FISH-метода

В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК. Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся.

Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд).

После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1. Подготовка гистологического или цитологического препарата.

Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация.

При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2. Предварительная обработка (если необходимо).
Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация.
Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.

4. Гибридизация.
После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5. Промывка.
После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6. Контр-окрашивание.
При помощи флуоресцентных красителей (DAPI – 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа. Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

Перейти в раздел Приборы и реагенты для FISH – анализа 

* – Материал подготовлен на основе информации открытых источников.

Источник: https://www.ld.ru/reviews/ilist-4352.html

WikiMedForum.Ru
Добавить комментарий